Blog

KNAUER, vodilni evropski proizvajalec kromatografskih sistemov, je objavil strokovni članek, ki zelo praktično in razumljivo razloži nekaj, kar v HPLC pogosto podcenjujemo: kako močno priprava pufrov in mobilnih faz vpliva na vaše kromatografske rezultate.

V nadaljevanju se osredotočamo na pripravo pufrov, medtem ko bo priprava mobilnih fazah predstavljena v ločenem prispevku (2. del).

Zakaj so pufri in mobilne faze pomembni v HPLC?

Pufri in mobilne faze so pogosto spregledani junaki HPLC analiz, a vendar igrajo ključno vlogo za njihovo uspešnost. Če jih pripravimo pravilno, proces kromatografije teče gladko – zagotovljeno je stabilno delovanje sistema, rezultati so ponovljivi in ločljivost je dobra. V primeru nepravilne priprave pa lahko pričakujemo težave, kot so raztegnjeni vrhovi, spreminjajoči se retencijski časi ali celo pojav namišljenih vrhov (t.i. ghost peaks).

Glavni namen uporabe pufrov v kromatografiji je uravnavanje pH vrednosti mobilne faze, saj ima večina analitov kisle ali bazične skupine. PH močno vpliva na ionizacijo analitov, njihovo polarnost in posledično na zadrževanje v koloni. Že majhne spremembe pH (npr. 0,1 enote) lahko bistveno podaljšajo retencijski čas ali vplivajo na ločljivost, zato je stabilizacija pH ključnega pomena. Dobra praksa priprave pufrov pomeni nadzor nad pH, s katerim uravnavamo retencijo, povečamo selektivnost, dosežemo lepe Gaussove vrhove in hkrati podaljšamo življenjsko dobo kolon.

Kako pripraviti pufre

Priprava pufrov za HPLC je deloma znanost, deloma umetnost – in včasih tudi malo fizična vadba – če močno stresate merilne bučke. Cilj je pripraviti pufrsko raztopino z natančno določenim pH, ki med analizo ostane stabilen.

Priporočila in osnovni koraki za pripravo pufrov so sledeči:

1. Izbira ustreznega pufra (pKₐ)

Izberemo pufrski sistem, katerega pKₐ je čim bližje ciljnemu pH (±1 enota), saj tam pufri najbolje delujejo. Napačna izbira pomeni slabo pufrsko kapaciteto, kar vodi v nestabilen pH in spremenljivo obnašanje analitov.

2. Določitev koncentracije pufra

Koncentracija pufra mora biti dovolj visoka za stabilen pH, vendar ne prevelika, da ne povzroči obarjanja ali visokega tlaka. Pogosto se priporoča uporaba približno 5 – 50 mM pufrske soli ali dodatek kisline okoli 1% (v/v) v končno mobilno fazo, pri čemer izberemo najnižjo koncentracijo, ki še zagotavlja dobro ponovljivost in obliko vrhov.

3. Izbira reagentov

Priporoča se uporaba visoko čistih (HPLC-grade) kemikalij in deionizirane vode, da preprečimo pojav nečistoč in namišljenih vrhov. Pazimo tudi, da so reagenti skladni z virom detekcije (npr. UV ali MS), kar pogosto pomeni nizko UV-absorpcijo ali hlapnost.

4. Metode priprave pufra

Pufre lahko pripravimo z natančnim tehtanjem komponent, s titracijo do željenega pH ali z mešanjem ekvimolarnih raztopin kisline in baze. Ne glede na izbrano metodo je ključno, da je postopek standardiziran in vedno enak, saj spreminjanje postopkov lahko vpliva na rezultate.

5. Izogibanje neustreznim pufrom ali dodatkom

Nekateri pufri niso primerni za določene tehnike (npr. nehlapne soli v LC-MS ali pufri zunaj svojega pH območja). Poleg tega je treba paziti tudi na kompatibilnost komponent, da se izognemo obarjanju ali motnjam pri detekciji.

6. Nasveti za merjenje in prilagajanje pH

pH-meter vedno umerimo z vsaj dvema pufroma, ki obdajata ciljni pH (npr. pH 4 in 7, če merimo pH 5). Meritve izvajamo vedno pri sobni temperaturi, razen če HPLC analize potekajo pri bistveno drugačni temperaturi, saj se pH s temperaturo spreminja. Pomembno je, da pH izmerimo pred dodajanjem organskih topil, ker v mešanih vodno-organskih sistemih pH ni zanesljivo merljiv.

»Navidezni pH« v mešanicah voda/organsko topilo ni enak pravemu pH, zato se običajno navaja pH vodne faze. Za natančne meritve je pomembno tudi pravilno vzdrževanje pH-elektrode.

Priporočljiva laboratorijska praksa za preprečevanje kontaminacije mobilne faze je odvzem manjšega alikvota mobilne faze in merjenje pH alikvota.

Še več konkretnih in uporabnih nasvetov, kako pravilno pripraviti pufer, najdete v KNAUER-jevem članku. Članek ni le teoretičen, ampak zelo praktičen, saj opozarja tudi na to, kaj gre v praksi najpogosteje narobe in kako malenkosti odločajo o uspehu.

Celoten članek20 min branja